Działanie hamujące metabolizm i wzrost flawonoidów pochodzących z żurawiny w komórkach raka pęcherza moczowego
Działanie hamujące metabolizm i wzrost flawonoidów pochodzących z żurawiny w komórkach raka pęcherza moczowego
Wprowadzenie
Żurawina ( Vaccinium macrocarpon Ait. Ericaceae), rodzimy owoc w Ameryce Północnej, wzbudziła duże zainteresowanie opinii publicznej jako żywność funkcjonalna ze względu na jej potencjalne korzystne skutki zdrowotne, w tym zapobieganie rakowi. Pojawiające się dowody sugerują się in vitro aktywność przeciwnowotworową żurawiny w raku sutka, szyjki macicy, okrężnicy, jamy ustnej i raka prostaty, linie komórkowe 1 - 3 . Wykazaliśmy, że dostępny w handlu koncentrat soku żurawinowego może zapobiegać rakowi pęcherza moczowego w szczurzym modelu guza pęcherza moczowego przy użyciu rakotwórczego N-butylo-N- (4-hydroksybutylo) -nitrozaminy (OH-BBN) 4. W naszych poprzednich badaniach przewlekłe podawanie szczurom koncentratu żurawiny powodowało wykrywalne gromadzenie się kwercetyny i izoramnetyny w pęcherzu 5 . Wyniki ujawniły również, że składniki żurawiny ulegają szybkiemu metabolizmowi i wydalaniu z moczem szczurów. Te obserwacje doprowadziły nas do zidentyfikowania metabolitów żurawiny, które hamują wzrost komórek raka pęcherza moczowego, aby lepiej zrozumieć podstawy profilaktycznego działania soku żurawinowego.
Hamujący wpływ polifenoli żurawiny na karcynogenezę pęcherza jest prawdopodobny, ponieważ większość metabolitów jest wydalana z moczem 6 . Co ważne, stężenie tych substancji w moczu jest znacznie wyższe niż we krwi, przez co uroepithelium jest narażone na wysokie stężenia, które zwiększają ich potencjał przeciwnowotworowy. Na poparcie naszych wcześniejszych obserwacji dotyczących zapobiegania rakowi pęcherza moczowego u szczurów oraz w celu zbadania tej idei w kontekście ludzkiego raka, przedstawiamy tutaj bezpośrednie działanie hamujące wzrost niektórych flawonoidów pochodzących z żurawiny i ich metabolitów in vivo na hodowane ludzkie komórki raka pęcherza moczowego, ale nie unieśmiertelnione komórki urotelialne. Opisujemy również wychwyt komórkowy i metabolizm kwercetyny i jej analogów w ludzkiej linii komórkowej raka pęcherza SW-780.
Eksperymentalny
Materiały
Wzorce trihydratu rutyny, eteru tetrametylowego kwercetyny 3,7,3,4, peltatozydu (3-arabinoglukozylokwercetyny), kwercetyny, hiperozydu (kwercetyny 3- O- galaktozydu), kwercetyny (kwercetyny 3- O -ramnozydu), izoramnetyny, mirycynetyny -O-glukozyd kuromanin (cyjanidyny 3-O-glukozyd), chlorek ideanin (3- cyjanidyny O -galactoside), chlorek kwercetyna 3-O-glukozyd, kwercetyna 3,4” di-O-glukozyd proantocyjanidyny A2 dimeru zakupiono z Indofine Chemicals Inc. (Hillsborough, NJ, USA). 3-O-glukuronid kwercetyny zakupiono od Sigma Aldrich (St. Louis, MO). Rozpuszczalniki i odczynniki do wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) (metanol i acetonitryl) zakupiono w firmie Fisher (Norcross, GA, USA) i były one czystości HPLC.
Hodowlę komórkową
Nienowotworowe unieśmiertelnione ludzkie komórki urotelialne (SV-HUC), przejściowe komórki brodawczaka pęcherza (RT-4), przejściowe komórki raka (SW-780) i komórki raka płaskonabłonkowego (SCABER) otrzymano z ATCC i poddawano podhodowli co 3 -4 dni w podłożu RPMI-1640 uzupełnionym 10% FBS i 2 mM glutaminy, i inkubowano w temperaturze 37 ° C z 5% cO 2 i utrzymuje w subkonfluentnych gęstość 7 - 10. Przed każdym eksperymentem komórki poddawano działaniu trypsyny i wirowano w celu usunięcia pożywki i zawieszano w pełnej pożywce. Komórki (5000 / studzienkę) wysiano i hodowano z badanymi związkami lub bez, w końcowym zakresie stężeń 0,03-200 µM. Związki rozpuszczono w DMSO i rozcieńczono w pożywce wzrostowej, utrzymując końcowe stężenie 0,2% DMSO zarówno w próbkach doświadczalnych, jak i kontrolnych. Amid sulfidu sulindaku (10 µM) zastosowano jako kontrolę pozytywną. Po 72 godzinach inkubacji płytki testowe pozostawiono do ostygnięcia do temperatury pokojowej przez 10 minut, po czym dodano 100 µl odczynnika Promega CellTiterGlo na studzienkę, a następnie inkubowano przez dodatkowe 10 minut w temperaturze pokojowej. Powstałą luminescencję oceniano ilościowo przy użyciu wielomodowego czytnika mikropłytek PerkinElmer Victor 3V. Procent zahamowania wzrostu obliczono w następujący sposób, gdzie 100 oznacza żywotność próbek kontrolnych traktowanych nośnikiem (stężenie = 0): 100 - [100x (próbka)] / kontrola nośnika. Zatem średnio zahamowanie wzrostu próbek kontrolnych nośnika jest równe zeru. Siłę związków określono przy użyciu algorytmu nieliniowej odpowiedzi na dawkę (4-parametrowe dopasowanie logistyczne) za pomocą oprogramowania GraphPad Prism 5. Do analizy metabolitów wewnątrzkomórkowych komórki traktowano badanymi związkami (50 µM). Inkubacje kontrolne bez komórek przeprowadzono z DMSO w końcowym stężeniu 0,5% w pożywce. Po 3, 6, 9, 24 i 72 godzinach inkubacji pożywkę hodowlaną usunięto, a komórki przemyto lodowato zimnym PBS, oddzielono i poddano lizie metanolem. zahamowanie wzrostu próbek kontrolnych nośnika wynosi zero. Siłę związków określono przy użyciu algorytmu nieliniowej odpowiedzi na dawkę (4-parametrowe dopasowanie logistyczne) za pomocą oprogramowania GraphPad Prism 5. Do analizy metabolitów wewnątrzkomórkowych komórki traktowano badanymi związkami (50 µM). Inkubacje kontrolne bez komórek przeprowadzono z DMSO w końcowym stężeniu 0,5% w pożywce. Po 3, 6, 9, 24 i 72 godzinach inkubacji pożywkę hodowlaną usunięto, a komórki przemyto lodowato zimnym PBS, oddzielono i poddano lizie metanolem. zahamowanie wzrostu próbek kontrolnych nośnika wynosi zero. Siłę związków określono przy użyciu algorytmu nieliniowej odpowiedzi na dawkę (4-parametrowe dopasowanie logistyczne) za pomocą oprogramowania GraphPad Prism 5. Do analizy metabolitów wewnątrzkomórkowych komórki traktowano badanymi związkami (50 µM). Inkubacje kontrolne bez komórek przeprowadzono z DMSO w końcowym stężeniu 0,5% w pożywce. Po 3, 6, 9, 24 i 72 godzinach inkubacji pożywkę hodowlaną usunięto, a komórki przemyto lodowato zimnym PBS, oddzielono i poddano lizie metanolem. Inkubacje kontrolne bez komórek przeprowadzono z DMSO w końcowym stężeniu 0,5% w pożywce. Po 3, 6, 9, 24 i 72 godzinach inkubacji pożywkę hodowlaną usunięto, a komórki przemyto lodowato zimnym PBS, oddzielono i poddano lizie metanolem. Inkubacje kontrolne bez komórek przeprowadzono z DMSO w końcowym stężeniu 0,5% w pożywce. Po 3, 6, 9, 24 i 72 godzinach inkubacji pożywkę hodowlaną usunięto, a komórki przemyto lodowato zimnym PBS, oddzielono i poddano lizie metanolem.
Analiza LC-MS / MS
Analizę metabolitów żurawiny w komórkach SW-780 przeprowadzono za pomocą LC-MS / MS składającego się z modelowego autosamplera Shimadzu z chłodzeniem SIL-HT, urządzenia HPLC (Shimadzu Scientific Instruments, Inc. Columbia, MD, USA) oraz masy API 4000 spektrometr (Sciex, Concord, Ontario, Kanada). Chromatografię przeprowadzono na kolumnie Phenomenex Fusion C18 z odwróconymi fazami (150 × 2,0 mm id) (Torrance, CA, USA) z fazą ruchomą składającą się z rozpuszczalnika A (0,1% kwas mrówkowy) i rozpuszczalnika B (acetonitryl zawierający 0,1% mrówkowy kwas). Ustanowiono 11-minutowy gradient od 10% do 80% w ciągu pierwszych pięciu minut i osiągnięty do 100% B po 5,5 min. Utrzymywano go przez dalszą 1 minutę, a system powrócił do początkowych 10% B po 7,0 min.
Wyciek z kolumny wprowadzono do spektrometru mas z zastosowaniem jonizacji przez elektrorozpylanie (ESI) w trybie jonów ujemnych i dodatnich. Azot był używany jako nebulizator i gaz kurtynowy. Prąd i temperatura nebulizatora wynosiły odpowiednio 5 A i 300 ° C. Gaz zderzeniowy (N 2 ) został ustawiony na wysoką, a energia zderzenia wynosiła 30-86 eV (tryb jonów ujemnych) przy napięciu powielacza elektronów (1900 V). Do analizy monitorowania reakcji wielokrotnych (MRM) wykorzystano następujące przemiany masowe: kwercetyna m / z 301/151, izoramnetyna m / z 315/151 i 315/300, monoglukuronid kwercetyny m / z 477/301, glukuronid metylokwercetyny m / z 491 / 315, glukozyd kwercetyny / galaktozyd m / z463/301, glukozyd kwercetyny / glukuronid galaktozydu m / z 639/463, chinon kwercetyny m / z 302/153 i chinon glukuronidu kwercetyny m / z 478/302 (tryb jonów dodatnich). System LC-MS-MS był kontrolowany przez oprogramowanie BioAnalyst 1.4.2.
Wyniki
Flawonoidy pochodzące z żurawiny i ich działanie antyproliferacyjne
Działanie antyproliferacyjne niektórych flawonoidów pochodzących z żurawiny i ich metabolitów oceniono w panelu linii ludzkich komórek raka pęcherza moczowego. Jak pokazano wTabela 1, Kwercetyna 3-O-glukozyd, 3'-O-methylquercetin (izoramnetyny), kwercetyna, mirycetyna i wykazały umiarkowanie silne działanie z IC 50 wartości w zakresie od 8,7 do 92,4 | iM w komórkach raka pęcherza moczowego. Przeprowadzono ograniczone badanie zależności struktura-aktywność w celu określenia strukturalnego wymogu hamowania wzrostu wywołanego kwercetyną w różnych ludzkich komórkach raka pęcherza. W tym celu porównaliśmy antyproliferacyjną aktywność kwercetyny z jej analogami glikozydowymi i sprzężonymi metabolitami fazy II (metylowanymi i glukuronidowanymi) oraz innymi flawonoidami. W porównaniu z kwercetyną aglikonową, analogi glikozydowe kwercetyny, takie jak peltatozyd, kwercetyna 3-4'-di-O-glukozyd i trihydrat rutyny (Ryc.1) nie wykazywały aktywności hamującej wzrost. Jednak kwercetyna-3-O-galaktozyd i kwercetyna-3-O-ramnozyd wykazały słabszą aktywność niż kwercetyna 3-O-glukozyd (Tabela 1). Wskazują one, że rodzaj i liczba reszt cukrowych odgrywa ważną rolę w działaniach antyproliferacyjnych.
Struktury kwercetyny i jej sprzężonych analogów.
Tabela 1
Hamujący wzrost działania flawonoidów pochodzących z żurawiny w liniach komórkowych ludzkiego raka pęcherza moczowego *
| IC 50 (μM) | ||||
|---|---|---|---|---|
| Złożony | RT4 | SCABER | SV-HUC1 | SW780 |
| Kwercetyna | 92,39 | 24.25 | 81,18 | 43.43 |
| Isorhamnetin | 34,26 | 43,21 | > 200 | 12,51 |
| Myricetin | 72,68 | 30,26 | > 200 | 20,94 |
| Kwercetyno-3-O-glukozyd | 20.11 | 8.66 | 12.60 | 20.13 |
| Kwercetyno-3-O-galaktozyd | ND | ND | ND | 135,7 |
| Kwercetyna-3-O-ramnozyd | ND | ND | ND | 189,5 |
| Cyjanidyno-3-O-galaktozyd | ND | ND | ND | 84,49 |
| Cyjanidyno-3-O-glukozyd | ND | ND | ND | 169,3 |
| 3-O-glukozyd peonidyny | ND | ND | ND | 137,0 |
Podczas gdy izorhamnetyna wykazywała nieco lepszą aktywność w porównaniu z kwercetyną, metylacja w pozycjach 3,7,3 ', 4' straciła aktywność (dane niepokazane), co wskazuje na znaczenie grup hydroksylowych w pierścieniach A, B i C dla aktywności hamowania wzrostu . Ponadto izorhamnetyna i mirycetyna wykazały bardzo niską aktywność hamującą w prawidłowych ludzkich komórkach moczowo-nabłonkowych SV-HUC (IC50> 200 μM) w porównaniu z komórkami raka pęcherza (Tabela 1 i Ryc.2), podczas gdy pozostałe związki wykazywały podobne wartości działania antyproliferacyjnego między komórkami nowotworowymi a prawidłowymi. Wyniki te wskazują, że metylowany metabolit (izoramnetyna), ale nie związek macierzysty (kwercetyna), może być aktywnym metabolitem w zapobieganiu rakowi pęcherza.
Hamujące wzrost działania izorhamnetyny i mirycetyny na prawidłowe komórki moczowo-nabłonkowe i komórki raka przejściowego. Trzykrotne seryjne rozcieńczenia związków doświadczalnych dodano do czterech powtórzonych studzienek w każdej linii komórkowej wraz z nośnikiem kontrolnym (0,2% DMSO). Komórki inkubowano ze związkami przez 72 godziny. Zahamowanie wzrostu mierzono odczynnikiem CellTiterGlo®. Wartości IC50 i krzywe dawka-odpowiedź zdefiniowano za pomocą GraphPad Prism 5.
Zbadaliśmy również aktywność 3-O-glukuronidu kwercetyny - głównego metabolitu II fazy kwercetyny. Nie wykazywał aktywności hamującej wzrost nawet przy najwyższym stężeniu (200 µM) w linii komórkowej guza pęcherza SW-780. Chociaż wcześniej wykazano, że proantocyjanidyny z żurawiny mają działanie przeciwproliferacyjne w różnych liniach komórek nowotworowych 11 , dimer proantocyjanidyny (proantocyjanidyna A2), jedna z głównych proantocyjanin w soku owocowym żurawiny, nie wykazała znaczącej aktywności w niniejszym badaniu. Podobnie, antocyjany-3-O-galaktozyd cyjanidyny, 3-O-glukozyd cyjanidyny i 3-O-glukozyd peonidyny wykazywały słaby wpływ na komórki rakowe pęcherza SW-780 (Tabela 1).
Metabolizm komórkowy kwercetyny i jej analogów
Aby zbadać rolę komórkowego metabolizmu polifenoli żurawiny w profilaktyce raka, kwercetyna, kwercetyna galaktozyd, kwercetyna glukozyd i metabolity kwercetyny fazy II badano w komórkach SW-780 przy użyciu chromatografii cieczowej i tandemowej spektrometrii mas (LC-MS / MS). Po 3, 6, 9, 24 i 72 h ekspozycji supernatanty komórek usuwano, komórki przemywano lodowato zimnym PBS, odłączano, lizowano metanolem, a następnie analizowano metodą LC-MS / MS działającą w trybie MRM.
Analiza MRM ekstraktów komórkowych i supernatantów komórkowych wykazała, że poziomy kwercetyny i jej metabolitów II fazy (produkty glukuronidowane i metylowane) zmieniają się wraz z czasem inkubacji. Poziomy kwercetyny stopniowo zmniejszały się w czasie w obu supernatantach (Ryc.3) i próbki ekstraktu komórkowego, wskazując jego konwersję do metabolitów O-metylowanych i glukuronidowanych. Pojedynczy pik przy Rt 6,30 min, odpowiadający 3'O-metylokwercetynie, zaobserwowano po 3 godzinach po inkubacji; jednak dodatkowy pik, prawdopodobnie 4'O-metylokwercetyna, obserwowany przy Rt 6,12 min po 24 h ekspozycji na kwercetynę (Ryc.3). Metylokwercetyna osiągnęła najwyższy poziom po 9 h inkubacji zarówno w supernatancie komórek, jak iw lizacie. Podczas gdy glukuronidy kwercetyny stopniowo zmniejszały się w lizatach komórkowych z upływem czasu, supernatant komórkowy zebrany po 24 godzinach wykazywał ponad pięciokrotny wzrost stężenia w porównaniu do 3 godzin (Ryc.4).
Chromatogramy MRM pokazujące konwersję kwercetyny do metylowanych i glukuronidowanych kwercetyn w supernatancie komórek poddanych działaniu kwercetyny. [A] normy; [B] po 3 godzinach inkubacji; [C] 24-godzinna inkubacja w komórkach SW-780.
Zmiana stężenia kwercetyny (Q), 3'-O-metylokwercetyny (Me-Q) i 3-O-glukuronidu kwercetyny (Q-3-O-Glu) wewnątrz i na zewnątrz komórek po 3,6,9 i 24 h inkubacji kwercetyny w komórkach SW-780. Oś Y przedstawia stosunki liczebności w stosunku do 3-godzinnego punktu czasowego.
Dwa piki odpowiadające glukuronidowi kwercetyny (przejście masy m / z 477/301 w trybie jonów ujemnych) pojawiły się przy Rt 4,99 i 5,28 min (Ryc.3). Chociaż możliwe są cztery monoglukuronidy kwercetyny (7-, 3-, 4'- i 3'-glukuronidy), dwa piki obserwowane w niniejszym badaniu to prawdopodobnie 3- i 3 'lub 7-glukuronidy kwercetyny, ponieważ te produkty zostały zgłoszone jako formowane z najwyższą wydajnością 12 . Kwercetyna 3-O-glukozyd i jej analog galaktozydu nie tylko wykazywały zróżnicowane działanie na proliferację komórek, ale także pod względem ich metabolizmu. Ponieważ oba związki były obserwowane w znacznych ilościach w lizatach komórkowych w stanie nienaruszonym, hydroliza wiązania glikozydowego nie wydaje się być kluczowa dla ich wchłaniania do komórek. Jednak poziom glukuronidu 3-O-glukozydu kwercetyny okazał się być ponad dwukrotnie wyższy niż 3-O-galaktozydu kwercetyny (Ryc.5). Chociaż stwierdzono, że szybkość glukuronidacji wzorca galaktozydu jest niższa niż w przypadku wzorca glukozydowego w tych komórkach, większość glukuronidu pochodzącego z żurawiny in vivo prawdopodobnie pochodzi z galaktozydu lub ramnozydu, ponieważ są one obecne w znacznie wyższych wyjściach stężenia niż glukozyd.
Chromatogramy MRM pokazujące różnicę w tworzeniu glukuronidów w lizatach komórkowych, gdy komórki SW-780 były eksponowane na 3-O-glukozyd kwercetyny [A] i 3-O-galaktozyd kwercetyny [B] przez 72 godziny. Przemiany mas były m / z 301/151 (kwercetyna); 463/301 (3-O-glukozyd kwercetyny lub 3-O-galaktozyd kwercetyny), 639/463 (glukuronid 3-O-glukozydu kwercetyny lub 3-O-galaktozydu kwercetyny).
Kilka wewnątrzkomórkowych metabolitów o strukturach podobnych do kwercetyny chinonu / chinonu metidu tworzy się w komórkach guza pęcherza SW-780 po leczeniu przez 24 godziny. Analiza LC-MS / MS potwierdziła tworzenie się glukuronidów kwercetyny m / z 479 i jej metylowanego analogu m / z 493 oraz ich analogów chinon / chinonometid m / z 478 i 492 (o jedną jednostkę masy mniej niż ich związki macierzyste). Nasze obserwacje potwierdzają wcześniejsze doniesienia, w których stwierdzono, że tworzenie się gatunków chinonów znacznie wzrasta w czasie 13 , 14 . Na przykład, ilość kwercetyny glukuronidu chinonu wzrosła ponad 100-krotnie (3-24 godz.) W supernatantach komórkowych traktowanych kwercetyną (Ryc.6). Kiedy wykonano obojętny skan strat o wartości 176 Da w celu wykrycia wszystkich glukuronidów kwercetyny, jony odpowiadające glukuronidowi kwercetyny ( m / z 479), glukuronid kwercetyny chinonu ( m / z 478) i ich produkty monometylowane ( m / z 493 i 492) zostały również wykryte (dane niepokazane).
Chromatogramy MRM pokazujące konwersję kwercetyny do kwercetyny-chinonu i chinonu-glukuronidu kwercetyny w różnych punktach czasowych w supernatantach komórek SW-780. Zastosowano przemianę masową m / z 302/153 (chinon kwercetyny) i 478/302 (chinon glukuronidu kwercetyny).
Chinonowe analogi kwercetyny mają charakterystyczne jony produktowe w ich widmach MS / MS. Glukuronid kwercetyny m / z 479 w LC-MS / MS pojawił się przy Rt 5,2 min z jonem produktu m / z 303,1, podczas gdy jego analog chinonu przy Rt 5,1 min z jonem produktu m / z 302. MS / MS jonów m / z 302,0 i 303 im / z 316 i 317 wykazały nieco inne wzory fragmentacji i czasy retencji. Jon m / z 316 był wcześniej opisywany jako stabilizowany protonem rodzaj chinonu 13 .
Tworzenie metabolitów podobnych do kwercetyny chinonu jest znacząco różne w próbkach supernatantu komórkowego wystawionych na działanie kwercetyny, 3-O-glukozydu kwercetyny i 3-O-galaktozydu kwercetyny przez 72 godziny (Ryc.7). W porównaniu z glikozydami kwercetyny [7B i C], rodzaje chinonów pochodzące z aglikonu kwercetyny [7A] w komórkach wykryto na stosunkowo wyższych poziomach intensywności pików przy użyciu testu MRM. Komórki wystawione na działanie 3-O-galaktozydu kwercetyny [7C] wykazywały około pięciokrotnie mniej rodzajów chinonów niż kwercetyny 3-O-glukozyd. Wyniki te po raz pierwszy pokazują, że 3-O-glukozyd kwercetyny podlega większej reakcji glukuronidacji i metabolizmowi oksydacyjnemu niż jego analog galaktozy.
Chromatogramy MRM pokazujące, że tworzenie metabolitów kwercetyno-chinonopodobnych jest znacząco różne w próbkach supernatantów komórek poddanych działaniu 3-O-glukozydu kwercetyny [A], [B] kwercetyny i 3-O-galaktozydu [C] kwercetyny przez 72 godziny. Zastosowano przemianę masową m / z 302/153.
Na tworzenie się adduktu kwercetyny z glutationem (GSH) wskazywała obecność jonu m / z 608 [M + H] + w trybie jonów dodatnich. MS / MS jonu m / z 608 dodatkowo potwierdziło tworzenie się koniugatu glutationylowego kwercetyny (Ryc.8). Utrata ugrupowania glicyny z koniugatu glutationylowego jonu kwercetyny m / z 608 skutkowała jonami produktu m / z 533. Hong i Mitchelle 15 znaleźli glutationylokwercetynę ( m / z 608) i glutationylokwercetynę (chinon) m / z 606 w tryb jonów dodatnich. W ich badaniach MS / MS m / z 608 i 606 wykazały, że jony produktu m / z 335 i 333, odpowiednio. Jednak zaobserwowaliśmy intensywny jon produktu m / z 333 po MS / MS jonu m / z 608, co wskazuje, że jon produktu m / z 333 może istnieć w postaci chinonu, jak pokazano naRyc.8.
Widmo MS / MS glutationu kwercetyny m / z 608.0 [M + H] + w supernatancie komórek traktowanych kwercetyną po 72 h inkubacji.
Kwercetyna chinonowa jest chemicznie reaktywna i jest usuwana przez GSH. Wcześniejsze badania wykazały, że addukty glutationylokwercetyny powstają w komórkach, a następnie są wydzielane do pożywki inkubacyjnej 14 . W prezentowanych badaniach nie wiadomo było, czy ugrupowanie glutationu jest związane z kwercetyną. Chociaż 6- i 8-glutationylokwercetyny były, jak opisano wcześniej, 16 , sprzężenie glutationu może prawdopodobnie nastąpić na pierścieniu B kwercetyny poprzez formę O-chinonu. Dlatego struktura m / z 608 jest wstępnie przypisana, jak pokazano naRyc.8.
Dyskusja
Żurawina zawiera wiele flawonoidów, w których kwercetyna 3-O-galaktozyd występuje w największej ilości w proszku owocowym 4 . Kwercetyna była szeroko badana pod kątem jej właściwości przeciwnowotworowych 13 , 14 . Podczas gdy 3-O-glukozyd kwercetyny wykazywał silne działanie antyproliferacyjne w wielu liniach komórek raka pęcherza moczowego, w naszych badaniach kwercetyna 3-O-galaktozyd nie wykazał znaczącej aktywności hamującej wzrost. Wcześniejsze badania wykazały również, że 3-O-glukozyd kwercetyny jest lepszym cytotoksycznym flawonoidem in vivo w porównaniu do jego innych analogów 17. Dodanie ramnozy i disacharydu rutynozy do kwercetyny również wykazało osłabione działanie. Te koniugaty glikozydowe kwercetyny wykazywały podobne tendencje w poprzednich badaniach na ludzkich komórkach HL-60 z promieloleukemią 18 .
Aby określić, czy wpływ izomerycznego 3-O-glukozydu kwercetyny (aktywnej) i 3-O-galaktozydu kwercetyny (nieaktywnej) na hamujący wzrost komórek jest powiązany z ich metabolizmem w komórkach nowotworowych, komórki SW-780 inkubowano z tymi związkami i ich metabolizm zbadano metodą LC-MS / MS. W porównaniu z 3-O-glukozydem kwercetyny, 3-O-galaktozyd kwercetyny podlega stosunkowo niewielkiemu metabolizmowi, na przykład hydrolizie do aglikonu, glukuronidacji i metabolizmowi oksydacyjnemu. Chociaż hiperozyd (kwercetyna-3-O-galaktozyd) jest głównym związkiem w żurawinie i stosunkowo nieaktywnym w teście in vitro, profilaktycznym działaniem żurawiny przeciwko karcynogenezie pęcherza jest prawdopodobnie kombinatoryczne działanie aglikonu kwercetyny i jej sprzężonych analogów.19 .
Wchłanianie, metabolizm, farmakokinetyka i biologiczne skutki kwercetyn zależą od ich struktury chemicznej i badanych układów biologicznych. Glukuronidy kwercetyny są głównymi krążącymi metabolitami II fazy u ludzi. Badania in vitro wykazały, że glukuronidowane metabolity polifenoli są bardziej hydrofilne, mniej aktywne lub nieaktywne i lepiej eliminowane niż ich odpowiedniki aglikonowe 20 .
W naszych badaniach 3-O-glukuronid kwercetyny nie wykazywał silnego działania hamującego wzrost komórek na komórki raka pęcherza. Być może, w przeciwieństwie do innych typów komórek, komórki pęcherza moczowego są narażone na zasadniczo wszystkie toksyczne metabolity z tą modyfikacją, rozsądne jest oczekiwanie, że są one przystosowane do ich wykluczania / usuwania.
Wcześniejsze badania wykazały, że w działaniu kwercetyny i jej metabolitów in vivo pośredniczą wewnątrzkomórkowe metabolity 13 . Istnieje większe prawdopodobieństwo, że kwercetyna występuje jako półchinonowa forma rodnika i jako produkt chinoidalny i mogą być odpowiedzialne za antyproliferacyjne działanie kwercetyny 21 . W obecnych badaniach kwercetyna i metabolity podobne do kwercetynchinonu mogą hamować wzrost komórek guza pęcherza w komórkach traktowanych kwercetyną. Z kolei działanie hamujące wzrost kwercetyny 3-O-glukozydu nie wydaje się być związane z jej metabolitami komórkowymi, ponieważ wytwarza on znacznie mniej związków podobnych do chinonu w porównaniu z kwercetyną aglikonową. Takie metabolity mogą wchodzić w interakcje z celem związanym z błoną lub zewnątrzkomórkowym, wywierając swoją aktywność przeciwproliferacyjną13 , 22 .
Generalnie, wychwyt flawonoidowych O-glikozydów jest poprzedzony hydrolizą, po której następuje rekoniugacja (glukuronidacja / siarczanowanie i metylacja), w której metabolizm jest kontrolowany przez specyficzność i dystrybucję enzymów katalizujących reakcję 23 , 24 . Jednak w lizatach komórkowych wykryto wysokie poziomy nienaruszonego 3-O-galaktozydu kwercetyny i 3-O-glukozydu kwercetyny, co wskazuje, że hydroliza O-glikozydu nie jest niezbędna do wychwytu komórkowego (Ryc.5). Wchodzenie kwercetyny do komórek może być ułatwione przez lipidy i białka błonowe, dzięki czemu jest ona bardziej rozpuszczalna w środowisku wodnym 25 .
Zazwyczaj aglikony polifenolowe mogą być związkami aktywnymi in vivo 24 , 26 . Jednak spośród testowanych flawonoidów najsilniejsze działanie wykazał kwercetyna 3-O-glukozyd. Ponieważ glukuronidacja jest powszechnie uważana za etap detoksykacji w metabolizmie kwercetyny 27 , glukuronid kwercetyny nie wykazuje działania hamującego wzrost w liniach komórkowych guza pęcherza moczowego.
Pod względem chemicznym chinony są utleniaczami i mają właściwości elektrofilowe, a ekspozycja na te chemikalia jest znana jako cytotoksyczna. W biologicznych działaniach polifenoli mogą pośredniczyć wewnątrzkomórkowe metabolity chinon / chinonometid. Kwercetyna w wyższych stężeniach (> 100 μM) wytwarza toksyczne chinony, które wykazują działanie cytotoksyczne i apoptotyczne 28 . Zatem kwercetyna może działać jako prooksydant i toksyczny polifenol. Jednak chinon / chinonometidy są reaktywne i szybko reagują z GSH, tworząc odwracalny addukt GSH. Stabilność tych adduktów tiolowych może wahać się od minut i godzin, a zatem są one stosunkowo niestabilne 29 .
Wcześniej wykazaliśmy, że składniki żurawiny ulegają szybkiemu metabolizmowi i wydalaniu z moczem szczurów, a kwercetyna i 3'-O-metylokwercetyna są obecne w tkance pęcherza moczowego, co potencjalnie pozwala im hamować karcynogenezę pęcherza moczowego 5 . Wyniki tego badania wykazały, że działanie hamujące wzrost metylowanego metabolitu kwercetyny (3'-O-metylokwercetyny) jest silniejsze niż kwercetyny, podczas gdy 3-O-glukuronid kwercetyny nie wykazywał efektów. Dane te ponadto sugerują, że w działaniu kwercetyny mogą pośredniczyć jej metylowane koniugaty, z wyjątkiem chinonów. Podkreśla również znaczenie metabolizmu polifenoli w profilaktyce raka pęcherza poprzez diety bogate w żurawinę.
Oprócz metabolizmu w górnej części jelita, większa część wychwytu i metabolizmu polifenoli, w tym proantocyjanidyn, zachodzi w okrężnicy, gdzie rezydentna mikroflora wytwarza metabolity, które mogą podlegać dalszemu metabolizmowi po wejściu do krążenia ogólnoustrojowego. Metabolizm drobnoustrojów może skutkować poważnymi przemianami strukturalnymi polifenoli, takimi jak rozszczepienie wiązania glikozydowego, redukcja wiązania podwójnego, dehydroksylacja, demetylacja, dekarboksylacja i rozszczepienie pierścienia 30 . Przyszłe badania powinny być skierowane na testowanie metabolitów drobnoustrojów pod kątem ich działania przeciwnowotworowego.
Wniosek
Składniki żurawiny: kwercetyna 3-O-glukozyd, izorametyna, mirycetyna i aglikon kwercetyna wykazują zależne od dawki działanie hamujące wzrost komórek w stosunku do komórek raka pęcherza moczowego i dlatego mogą być odpowiedzialne za zapobiegawcze działanie żurawiny, jak donosiliśmy przy użyciu szczurzego modelu indukowanego chemicznie rak pęcherza moczowego 4 . Chociaż 3-O-glukozyd kwercetyny podlega większej reakcji glukuronidacji i metabolizmowi oksydacyjnemu niż jego analog galaktozydu, mechanizm leżący u podstaw działania hamującego wzrost komórek guza 3-O-glukozydu kwercetyny jest mniej wyraźny. Ponadto uzasadnione jest przeprowadzenie kompleksowych badań in vitro nad przeciwnowotworowym działaniem metabolitów tych polifenoli w górnej części jelita i drobnoustrojów.
Podziękowanie
Badania te zostały poparte przez NIH (R21CA137519-01 (JP, PI). Laboratorium UAB Targeted Metabolomics and Proteomics Laboratory jest wspierane przez UAB-UCSD O'Brien Acute Kidney Injury Center (P30 DK079337), UAB Lung Health Center ( HL114439 , HL110950 ) oraz UAB Center for Free Radical Biology. Zakup spektrometrów mas w Laboratorium Targeted Metabolomics and Proteomics pochodzi z funduszy przekazanych przez NCRR na AB SCIEX 5600 TripleTOF (S10 RR027822-01) oraz UAB Health Services Foundation General Endowment Fundusze na AB SCIEX 4000. Autorzy pragną również podziękować Rayowi Moore'owi, Landonowi Wilsonowi, Alireza Arabshahi i Tylorowi Berryhillowi (Laboratorium Targeted Metabolomics and Proteomics, UAB) za ich wsparcie i pomoc w analizie spektrometrii mas.
Lista skrótów
| OH-BBN | N-butylo-N- (4-hydroksybutylo) -nitrozoamina |
| HPLC | Wysokosprawna chromatografia cieczowa |
| ATCC | Kolekcja amerykańskiej kultury typowej |
| SVHUC | nienowotworowe unieśmiertelnione ludzkie komórki nabłonkowe |
| RT-4 | komórki brodawczaka pęcherza przejściowego |
| SW-780 | przejściowe komórki raka |
| SCABER | komórki raka płaskonabłonkowego |
| DMSO | sulfotlenek dimetylu |
| PBS | sól fizjologiczna buforowana fosforanem |
| LC-MS / MS | chromatografia cieczowa tandemowa spektrometria mas |
Przypisy
Konflikt interesów
Autorzy oświadczają, że nie mają konfliktu interesów.
Oświadczenie o ujawnieniu
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Komentarze
Prześlij komentarz